Основой ПЦР является повторяющиеся циклы in-vitro синтеза определенного участка ДНК, приводящие к геометрическому росту (амплификации) количества копий этого участка ДНК в растворе. В результате каждого цикла амплификации происходит удвоение количества копий ДНК (ампликонов) в растворе, а повторение цикла амплификации приводит к увеличению количества молекул ДНК в геометрической прогрессии.

Механизм амплификации ДНК
Рисунок 1. Механизм амплификации ДНК

Механизм амплификации ДНК

Удвоение происходит в результате ферментативного синтеза комплементарной нити ДНК в условиях циклического изменения температуры реакционной смеси в соответствии с температурно-временным режимом амплификации. Изменением температуры проводится управление тремя физико-химическими процессами в растворе (Рисунок 1):

  1. При температуре 95ºC проходит диссоциация двухцепочечных молекул ДНК с образованием двух отдельных нитей ДНК, стадия денатрурации;
  2. При охлаждении раствора до 55÷65°C к одноцепочечным молекулам ДНК присоединеняются олигонуклеотиды (праймеры) и ДНК-полимераза, стадия гибридизации;
  3. При температуре 72ºC происходит синтез комплементарной нуклеотидной последовательности, стадия элонгации.
Рисунок 2. Рост количества ДНК в растворе

Cтадии гибридизации и элонгации сложно разделить и они часто объединяются в одну. Оптимальная температура гибридизации зависит от нуклеотидной последовательности праймеров, а ДНК-полимеразы имеют довольно широкие температурные границы активности. Поэтому на практике, особенно в ПЦР в режиме реально времени, где амплифицируются короткие участки ДНК, используют термоцилирование между температурами 95°C и 60÷65°C. К тому же это позволяет экономить время, которое тратится на нагрев и охлаждение растворов.

Состав раствора для ПЦР

Состав реакционной смеси для проведения ПЦР может сильно варьироваться в зависимости от природы и качества выделенной ДНК, природы и свойств фермента,  нуклеотидной последовательности праймеров и принципов детектирования ампликонов. Стандартная реакционная смесь содержит целевую или контрольную ДНК, пару коротких олигонуклеотидов (праймеров), смесь трифосфатов дезоксирибонуклеотидов, термостабильную ДНК-полимеразу, ионы магния и компоненты буферной системы (Трис-HCl).


Приблизительный качественный и количественный состав ПЦР-смеси приведен в таблице:

Компонент Содержание Роль
Целевая ДНК  10 фг ÷ 10 мг  Выполняет роль матрицы для синтеза
Праймеры  0,1÷1,0 мкМ  Ограничивают и определяют амплифицируемый участок ДНК, являются затравкой для синтеза
ДНК-полимераза  0,2÷2,0 единицы  Фермент, осуществляющей синтез комплементарной последовательности
Ионы магния (Mg2+)  0,5÷5,0 мМ  Кофермент ДНК-полимеразы
Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)  по 200 мкМ  Используются для синтеза комплементарной последовательности
Буферный раствор  pH=8.3, 50мМ KCl  Создание ионной силы раствора и pH

 Кроме указанных компонентов, ПЦР-смесь может содержать:

  • Флуоресцентные зонды или интеркалирующие красители, которые позволяют проводить детектирование ампликонов;
  • Контрольную ДНК, в случае использования мультиплексной ПЦР амплификация контрольного участка ДНК позволяет выявить ложноотрицательные результаты;
  • Желатин или бычий сывороточный альбумин, позволяют снизить или нивилировать влияние ингибиторов в анализируемом образце (часто содержатся в буфере, посталяемом с ДНК-полимеразой);
  • Неионногенные детергенты (Triton-X100, Tween-80, DMSO), помогают провести денатурацию исходной ДНК.

Компоненты ПЦР-смеси можно разделить на две группы, специфические и неспецифические. Это дает возможность проводить смешение компонентов в несколько этапов для удобства работы и снижения трудозатрат. Сначала смешиваются неспецифические реактивы (вода, буфер, раствор ионов магния, ДНК-полимераза и т.д), затем эта смесь разливается по пробиркам и в нее добавляются специфические реактивы (праймеры и зонды). Далее в пробирки добавляется анализируемый образец.

Добавить комментарий


Защитный код
Обновить