В процессе полимеразной цепной реакции происходит экспоненциальное увеличение количества определенного участка ДНК до количеств, достаточных для детектирования или дальнейшей работы. Эта особенность позволяет выявить наличие единичных молекул ДНК в образце. Однако такая выдающаяся чувствительность является и основным источником проблем. Появление ложноположительных результатов, которые являются результатом загрязнения образца целевым фрагментом ДНК, приводят не только к остановке деятельности лаборатории, но и необходимости повторения уже проведенных анализов, т.е. подрывает доверие к лаборатории.

Организация однонаправленности потока образцов, реактивов и работ является ключевым фактором в эффективности работы лаборатории. Схематично этапы работ и соответствующие им функциональные зоны представлены на рисунке 1.

Приготовление и хранение реактивов

Высокая чувствительность ПЦР требует наличия чистых реактивов. Это обеспечивается как правильной организацией работы в лаборатории, так и наличием чистой зоны, в которую исключено попадание продуктов реакций и посторонней ДНК. Принципы работы в данной зоне должны гарантировать чистоту исходных и рабочих реактивов. К правилам работы в данной зоне можно отнести:

  1. Исключается допуск персонала, который находился в зонах проведения ПЦР и работы с продуктами ПЦР;
  2. Предпочтительно проводить работы в начале рабочего дня, перед началом работам в других зонах;
  3. Рекомендуется использовать мастер-миксы, количество которых соответствует объему запланированной на день работы;
  4. При получении новых реактивов их желательно аликвотировать

В этой зоне должны обеспечиваться и необходимые условия для хранения реактивов (холодильник, морозильная камера) и гарантирование чистоты реактивов и ПЦР-смеси. Ферменты для ПЦР (ДНК-полимеразы, обратные транскриптазы и т.д.), стоковые растворы праймеров, зондов и красителей требуют хранения при -20ºC. Хранение рабочих растворов для использования в течении дня рекомендуется проводить в холодильнике.

Зона работы с образцами

В данной зоне может проводиться несколько операций:

  1. Регистрация, маркирование и сортировка проб;
  2. Аликвотирование проб, создание резервного фонда;
  3. Выделение ДНК/РНК.

Стадия выделения ДНК является наиболее трудоемкой в проведении ПЦР. Различие в качестве, типе и количестве проб обуславливает распространение преимущественно ручных методик выделение ДНК. Правильная организация рабочего места, упрощение систем выделения (сорбция на магнитных частицах или спин-колонках) и использование вспомогательного оборудования позволяет значительно снизить трудоемкость этой стадии. Автоматические системы выделения ДНК/РНК нашли применение только в узких областях.

Методики пробоподготовки очень разнообразны, могут заключаться как в простом разбавлении пробы, так и в проращивании спор. Выбор оптимальной методики зависит от типа пробы и поставленных задач. Но в любом случае стадия выделения ДНК/РНК  сопряжена с определенными рисками, которые необходимо оценивать и контролировать:

  1. Недостаточная полнота или чистота выделения ДНК/РНК, особенно при высокой вариабельности исходных проб. Мониторинг осуществляется за счет добавления контрольного количества ДНК и амплификация его в режиме реального времени.
  2. Кросс-контаминация образцов, особенно в случае высокого потока проб со значительным различием в исходном содержании ДНК/РНК. Для выявления этого эффекта проводится обязательный анализ холостой пробы.

Зона приготовления ПЦР-смеси

В этой зоне проводится добавление раствора ДНК/РНК, выделенного на предыдущей стадии, к раствору остальных реактивов. На этой стадии также важно минимизировать количество операций, чтобы снизить вероятность контаминации реактивов и ошибки оператора.

Для рутинных поточных анализов актуально использовать лиофилизированные реактивы (частично или полностью). Реактивы для ПЦР можно условно разделить на две группы: универсальные (ДНК-полимераза, буфер, dNTP, Mg2+) и специфические (праймеры, зонды). Специфические реактивы могут легко быть лиофилизированы в пробирках и использование таких наборов значительно снижает вероятность ошибок в приготовлении ПЦР-смеси. В случае анализа нескольких проб на несколько генетических элементов, раствор пробы смешивается с раствором универсальных реактивов, а затем аликвотируется в пробирки с в которых находятся разные праймеры и зонды. Схема приготовления реактивов проста и практически исключает возможность перепутывания реактивов (Рисунок 2).

Стадию приготовления ПЦР-смеси можно значительно упростить, если использовать пробирки, в которых лиофилизированны не только праймеры и зонды, но и ДНК-полимераза. Такой подход имеет несколько существенных преимуществ:

  1. Стадию смешения раствора ДНК/РНК с компонентами буфера, dNTP, Mg2+ можно интегрировать в стадию пробоподготовки, например, элюирование ДНК/РНК с сорбента можно проводить в раствор содержащий компоненты буфера, dNTP и Mg2+. Приготовление ПЦР-смеси будет заключаться только в аликвотировании раствора по пробиркам с лиофилизированными реактивами;
  2. В лаборатории, фактически, допускается отсутствие чистой зоны приготовления и хранения реактивов, так как стадия приготовления мастер-миксов отсутствует;
  3. Лиофилизированные реактивы могут храниться при комнатной температуре, холодильника и морозильной камеры уже не требуется.

Стадия приготовления ПЦР-смеси опасна не только кросс-контаминацией образцов, но и вероятностью перепутывания соответствующих пар образцов и праймеров/зондов, особенно при анализе, когда каждый образец имеет свой набор генетических элементов. Использование правильно организованного рабочего места, мастер-миксов и лиофилизованных реактивов позволяет значительно снизить вероятность ошибок.

 

Добавить комментарий


Защитный код
Обновить