На этапе лизиса образца необходимо обеспечить доступность нуклеиновых кислот для последующей очистки. Лизис образца может быть нескольких типов:

  • Ферментативное (протеиназы)
  • Химическое (хаотропные агенты, детергенты)
  • Механическое (перетирание, измельчение, ультразвук, заморозка/оттаивание, нагрев)

В методике выделения проб стадия гомогенизирования образца может включать комбинацию нескольких типов лизиса, последовательно или одновременно. Например, перетирание, затем обработка протеиназой и потом хаотропными агентами. Отдельная стадия гомогенизации может отсутствовать, а разрушение клеток происходит на стадии нагрева ПЦР-смеси при активации термостабильной полимеразы.

Для ферментативного гидролиза протеинов используется протеиназы, обычно протеиназа К. На этой стадии разрушаются белки, в том числе те, которые связаны с нуклеиновыми кислотами (гистоны) и которые гидролизуют нуклеиновые кислоты (нуклеазы). Протеиназа К устойчива к денатурирующим агентам (SDS, мочевина), поэтому их добавление повышает эффективность гидролиза за счет увеличения доступности пептидных связей.

Химическая обработка образца может проводится хаотропными агентами, детергентами или их смесью. Цианогуанидин, иодистый калий, хлорид цинка разрушают клеточную стенку. Tween, SDS, Nonidet, Laureth и Triton увеличивают проницаемость мембран. Nonidet P40 лизирует клеточную мембрану эукариотов, но не разрушает ядерную оболочку. Действие реагентов может быть усилено физическими факторами: нагрев, обработка ультразвуком, измельчение.

Механическое разрушение клеток проводится в случае анализа образцов с твердой или, наоборот, с легко разрушаемой клеточной мембраной. Гомогенизацию образцов с твердой оболочкой (споры, грибы, растения) проводят перетиранием. Эффективность перетирания повышается, если образцы предварительно заморозить, например, в жидком азоте, а в ступку при этом добавить небольшой объем жидкого азота. В случае, если клетки имеют слабую клеточную стенку и от ингибирования ПЦР можно избавиться разбавлением пробы, то кипячением или проведя несколько циклов заморозки и оттаивания. Для кипячения можно использовать дистиллированную воду, которая дополнительно разрушает клетки за счет осмотического давления.

 

Добавить комментарий


Защитный код
Обновить