Хламидия трахоматис

Хламидия трахоматис - облигатная внутриклеточная бактерия, заражающая более 100 миллионов люди каждый год во всем мире половым путем [1]. Большинство людей не знают о ней, потому что она часто проходит бессимптомно, может привести к серьезным неблагоприятным исходам у женщин [2]. На данный момент существует большой выбор диагностических тестов, среди которых выделяются методы диагностики, основанные на ПЦР, благодаря высокой чувствительности и селективности. Однако распространение и появление новых штаммов, мутации в известных обуславливают постоянную актуальность работ по оценки применимости существующих и разработке новых тест-систем. К выбору диагностической метода необходимо взвешенно подходить, так как в случае локальные изменения в распространенности хламидийной инфекции могут быть связаны  с непригодностью теста регистрировать определенный штамм возбудителя [6,7]

 Методы диагностики

В лабораторной диагностике урогенетальной хламидийной инфекции в России используются следующие методы:

• бактериоскопический метод с окраской мазка по Гименезу или Романовскому–Гимзе;
• культуральные методы;
• иммунологические методы;
• молекулярно-биологические методы;

 Методы амплификция нуклеиновых кислот выделяются среди этих методов из-за высокой чувствительности и являются рекомендованными методами для диагностики [1]. Культуральный метод диагностики может быть использован только в случае невозможности использования методом амплификации нуклеиновых кислот. Экспресс-тесты, которые проводятся во время обращения пациента, в основном являются иммуноферментными и не могут обеспечить удовлетворительную чувствительность. Их результаты необходимо интерпретировать с осторожностью и анализировать совместно с клинической картиной.

Методы амплификации нуклеиновых кислот

Валидированные и надежные тесты, основанные на амплификации нуклеиновых кислот, рекомендуются для диагностики симптомных и бессимптомных урогенетальных инфекций. Диагностические тесты для диагностики можно разделить на несколько больших групп по типу мишени:

• Ген 16S или 23S. Нуклеотидная последовательность этих участков характеризуется высокой консервативностью и может быть использована для выявления всех представителей Chlamydiaceae.
• Ген главного белка наружной мембраны (omp1). На основе этого белка проводится классификация C. trachomatis на серовары В настоящее время установлено, что серовары C. trachomatis от A до С вызывают классическое заболевание глаз – трахому, тогда как серовары от D до K вызывают урогенитальную инфекцию и поражение глаз, а серовары L1, L2 и L3 – более инвазивные формы инфекции, передающейся половым путем, - венерическую лимфогранулему с характерным поражением лимфатических узлов.
• Криптическая плазмида. Мультикопийность плазмиды позволяет значительно увеличить чувствительность анализа, что широко используется на практике. Однако, появление и распространение безплазмидных штаммов приводит к необходимости комбинировать системы и проводить дополнительные исследования.
• рРНК. Мультикопийность этой мишени и ее консервативность позволяют разработать чувствительные и специфические тест-системы. Необходимость обеспечить стабильность РНК до момента анализа и проведение стадии обратной транскрипции могут нивелировать все преимущества.

Коммерческие системы

В данный момент существует множество коммерческих диагностических тестов, качество которых подтверждено соответствующими документами и сертификатами. Наиболее широко распространенным и общепринятым референтным методом диагностики является Cobas Amplicor производства Roche Diagnostic Systems. Мишенью для праймеров в данном тесте является криптическая плазмида, которую содержат почти все штаммы бактерии. Однако, распространение новых бесплазмидных штаммов хламидии, например, "шведский" вариант, требует более комплексного подхода к диагностики. Для надежной интерпретации отрицательных результатов необходимо проводить дополнительный контроль по тестам, которые используют другую мишень, например, ген главного структурного белка наружной мембраны [6, 7].

Использование криптической плазмиды в качестве мишени для амплификации дает преимущество в чувствительности за счет мультикопийности. В тесте NASBA мишенью является рибосомная РНК, копийность которой может достигать нескольких десятков тысяч на бактериальную клетку. С точки зрения чувствительности - РНК является идеальной мишенью [8], для дифференцирования серотипов мишенью должен быть ген omp1, компромиссными вариантами могут служить тест-системы на ген 16S, 23S или криптическую плазмиду. При рассмотрении тест-систем, надо помнить, что для методики выделения геномной ДНК, плазмидной и РНК будут отличаться.

Разработка тест-систем

Принципиальным преимуществом использования собственных тест-систем является наличие информации о мишени и праймерах. В случае появления и описания нового штамма можно оперативно оценить пригодность используемых тестов к диагностики нового штамма. Разработка мультиплексной системы позволяет объединить несколько мишеней (например, геномная ДНК и криптическая плазмида) для увеличения достоверности анализа. Конечно, методика подготовки пробы в этом случае должна быть унифицирована для выделения геномной ДНК и плазмиды.

Ген 16S рДНК

Ген 16S рибосомальной ДНК привлекателен в качестве мишени для амплификации, так как он хорошо изучен, стабилен и имеет две копии в геноме. База данных NCBI содержит одну проверенную (refseq) последовательность 16S (Chlamydia trachomatis strain HAR-13 16S ribosomal RNA). В открытом доступе можно легко найти нуклеотидную последовательность праймеров и характеристики разработанных на их основе тест-систем [9, 10]. Эта информация может служить неплохой отправной точкой при разработке, но, как и любая любая другая информация, ее применение требует проверки и актуализации.

Ген главного белка наружной мембраны (MOMP)

Еще одной распространенной мишенью для амплификации является ген главного белка наружной мембраны. Его последовательность также хорошо описана и изучена [11], содержит 4 гипервариабельных участка, которые разделены высоко консервативными участками. По аминокислотной последовательности этого гена определяется серовар возбудителя, поэтому в литературе описано достаточно систем [12], праймеры в которых находятся на консервативных участках. Но постоянное появление новых данных о новых штаммах требует регулярной актуализации используемых наборов.

Плазмидная ДНК

ДНК C. trachomatis представлена кольцевой хромосомой и криптической плазмидой. Многокопийность плазмиды делает ее привлекательной мишенью для разработки чувствительных тест-систем [13]. Однако, наличие плазмида не является жизненно необходимым для микроорганизма [14] и уже обнаружены и описаны беcплазмидные штаммы [9], обнаружение которых возможно только с использованием геномных тест-систем [15].

Мультиплексные тест-системы

Диагностика хламидиоза является значимой социальной задачей и обуславливает актуальность разработок надежных и чувствительных методов определения. Как показано ранее, любая мишень для амплификации обладает тем или иным недостатком, поэтому появились работы по разработке мультиплексных тестов, в которых используются несколько мишеней для обнаружения одного организма. Это позволяет компенсировать отсутствие или какие-либо изменения одной из мишеней и, следовательно, значительно увеличить надежность определения [16].

Литература

1. Lanjouw E., Ouburg S., de Vries H.J., Stary A., Radcliffe K., Unemo M. 2015 European guideline on the management of Chlamydia trachomatis infections // International Journal of STD & AIDS, 2015
2. Lanjouw E., Ossewaarde J.M., Stary A., Boag F., van der Meijden W.I. Европейские рекомендации по диагностике и лечению инфекций, вызываемых Chlamydia trachomatis // 2010
3. Livengood C., Wrenn J. Evaluation of COBAS AMPLICOR (Roche): Accuracy in Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae by Coamplification of Endocervical Specimens // Journal of Clinical Microbiology, 2001, 39(8), 2928-2932
4. Ferrero D., Meyers H., Schultz D., Willis S. Performance of the Gen-Probe AMPLIFIED Chlamydia Trachomatis Assay in Detecting Chlamydia trachomatis in Endocervical and Urine Specimens from Women and Urethral and Urine Specimens from Men Attending Sexually Transmitted Disease and Family Planning Clinics // Journal of Clinical Microbiology, 1998, 36(11), 3230-3233
5. Манзенюк И.Н., Воробьева М.С., Волкова Р.А., Никитюк Н.М., Воронцова Т.Н., Потапова Т.Н., Шипулин Г.Ю., Комаров А.Б., Черный О.В. Результаты аттестации тест-систем для выявления ДНК Chlamydia trachomatis методом полимеразной цепной реакции // Биопрепараты, 2002
6. Шипицына Е., Золотоверхая Е., Крысанова А., Агне-Стадлинг И., Калитеевская О.,Савичева А., Бенькович А., Соколовский Е., Домейка М., Унемо М. Оценка методов амплификации нуклеиновых кислот, используемых в России для выявления Chlamydia Trachomatis // Журнал акушерства и женских болезней, 2008, 57(4), 44-54
7. Stary A., Tomazic-Allen S., Choueiri B., Burczak J, Steyrer K., Lee H. Comparison of DNA Amplification Methods for detection of Chlamydia thrachomatis in first-void urine from asymptomatic military recruits // Sexually Transmitted Diseases, 1996, 23(2), 97-102
8. Шипицына Е., Воробьева Н., Е., Савичева А., Соколовский Е., Гущин А., Рыжих П., Шипулин Г., Кротин П., Меркулова Л., Ландина О. Применение метода nucleic acid sequence-based amplification в реальном времени (NASBA-REAL-TIME) для диагностики урогенитальной хламидийной инфекции // Журнал акушерства и женских болезней, 2005, 54(4), 17-21
9. An Q., Radcliffe G., Vassallo R., Buxton D., O'brien W., Pelletier D., Weisburg W., Klinger J., Olive M. Infection with a plasmid-free variant chlamydia related to chlamydia trachomatis identified by using multiple assays for nucleic acid detection // Journal Of Clinical Microbiology, 1992, 30(11), 2814-2821
10. Vitrenko Y., Deryabin O. A dual-target strategy for the detection of Chlamydia trachomatis by real-time PCR // Biopolymers and Cell, 2018, 34(2), 117–128
11. Stephens R., Sanchez-Pescador R., Wagar E., Inouye C., Urdea M. Diversity of Chlamydia trachomatis major outer membrane protein genes // Journal of bacteriology, 1987, 169(9), 3879-3885
12. Roosendaal R., Walboomers J., Veltman O., Melgers I., Burger C., Blekers O., Maclaren D., Meijer C., Van Den Brule A. Comparison of different primer sets for detection of Chlamydia trachomatis by the polymerase chain reaction // Journal of Medical Microbiology, 1993, 38, 426-433
13. Mahony J, Luinstra K, Sellors J., Chernesky M. Comparison of plasmid- and chromosome-based polymerase chain reaction assays for detecting chlamydia trachomatis nucleic acids // Journal of Clinical Microbiology, 1993, 31(7), 1753-1758
14. Peterson E., Markoff B., Schachter J., Maza L. The 7.5-kb plasmid present in Chlamydia trachomatis is not essential for the growth of this microorganism / Plasmid, 1990, 23(2), 144-148
15. An Q., Radcliffe G., Vassallo R., Buxton D., O'Brien W., Pelletier D., Weisburg W., klinger J., Olive M. Infection with a plasmid-free variant chlamydia related to chlamydia trachomatis identified by using multiple assays for nucleic acid detection // Journal of Clinical Microbiology, 1992, 30(11), 2814-2821
16. Ma C. , Du J., He W. , Chen R., Li Y., Dou Y., Yuan X., Zhao L., Gong H., Liu P., Liu H. Rapid and accurate diagnosis of Chlamydia trachomatis in the urogenital tract by a dual-gene multiplex qPCR method // Journal of Medical Microbiology, 2019, 68, 1732–1739