В процессе полимеразной цепной реакции происходит экспоненциальное увеличение количества определенного участка ДНК до количеств, достаточных для детектирования или дальнейшей работы. Эта особенность позволяет выявить наличие единичных молекул ДНК в образце. Однако такая выдающаяся чувствительность является и основным источником проблем. Появление ложноположительных результатов, которые являются результатом загрязнения образца целевым фрагментом ДНК, приводят не только к остановке деятельности лаборатории, но и необходимости повторения уже проведенных анализов, т.е. подрывает доверие к лаборатории.
Организация однонаправленности потока образцов, реактивов и работ является ключевым фактором в эффективности работы лаборатории. Схематично этапы работ и соответствующие им функциональные зоны представлены на рисунке 1.
Зона проведения ПЦР
Полимеразная цепная реакция задумывалась Кэрри Мюллисом как способ синтеза большого количества ДНК для дальнейшей работы, например, клонирования. Позднее ПЦР стала решать диагностические задачи. От тех задач, которые стоят в лаборатории, зависит организация зоны амплификации.
В диагностических целях активно применяется ПЦР в режиме реального времени, которая не требует работы с продуктами и открытия пробирок. В этом случае зона амплификации должна обеспечить отсутствие контаминации лаборатории только в случае непредвиденных ситуаций. Поэтому, несмотря на то, что работа с продуктами ПЦР в лаборатории не предусмотрена, зона амплификации все равно рекомендуется выделять в отдельное помещение. Если диагностическая лаборатория проводит не только рутинную диагностику, но и разрабатывает реактивы, то подразумевается наличие зоны работы с продуктами ПЦР. Валидация набора реактивов подразумевает подтверждение специфичности амплификации. Это может быть сделано путем оценки длины амплифицируемого участка методом электрофореза в агарозном геле. Применение интеркалирующих красителей и проведение плавления ампликонов для этой цели ограничено из-за зависимости температуры плавления не только от длины участка, но и от нуклеотидной последовательности.
Данная зона является ключевой с точки зрения контроля контаминации лаборатории ампликонами. Персонал лаборатории может быть привязан к зоне приготовления ПЦР-смеси или зоне работы с продуктами ПЦР.
Зона работы с продуктами ПЦР
Организация работы в данной зоне является самым критичным элементом во всей ПЦР-лаборатории.