Вирус SARS-CoV-2 является седьмым из числа известных коронавирусов, которые способны заражать человека (коронавирусы человека). Четыре из этих вирусов - 229E, NL63, HKU1 и OC43 - являются эндемичными сезонными вирусами, которые, как правило, вызывают респираторные заболевания легкого течения. В 2002 г. и 2012 г. появились вирусы SARS-CoV и MERS-CoV, которые способны вызывать тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС) и отнесены ко II группе патогенности. С декабря 2019 г. распространение получил новый короновирус SARS-CoV-2. 11 марта 2020 г. ВОЗ объявила о начале пандемии COVID-19. SARS-CoV-2 включен в перечень заболеваний, представляющих опасность для окружающих (постановление Правительства Российской Федерации от 31 января 2020 г. № 66). В настоящее время диагностика острой инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, основана на методе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. В качестве мишеней обычно используются области генов вируса N, E, S и RdRP.

Геном SARS-CoV-2
Рисунок 1. Геном SARS-CoV-1.

SARS-CoV-2 имеет одноцепочечную положительную нить РНК длиной примерно 30 000 п.о. Геном вируса кодирует 27 белков, включая РНК-зависимую РНК полимеразу (RdRP) и 4 структурных белка: S - белок шипа, E - белок оболочки, M - белок мембраны и N - нуклеокапсидный белок (Рис. 1). В начале января 2020 г была получена первая последовательность генома SARS-CoV2 (MN908947). По мере распространения вируса, начинают создаваться и пополняться базы данных генетических последовательностей новых штаммов (NCBI, GISAID). Эти базы данных рекомендуется использовать для мониторинга мутаций, потенциально влияющих на эффективность теста.

ПЦР-системы

Первая тест-системой для определения вируса была разработана в Институте Вирусологии в Берлине еще до получения образцов вируса. Corman et al. искусственно синтезировали геном SARS-CoV-2 на основе генома SARS-CoV-1 и экспериментально подтвердили работоспособность системы. Для рутинного процесса был рекомендован анализ гена E в качестве инструмента скрининга первой линии с последующим подтверждающим тестированием с помощью анализа гена RdRp. Использование двухканальной системы детектирования при определении гена RdRp позволяет отличить SARS-Cov-2 (оба канала дают положительный результат) от SARS-CoV-1. В качестве альтернативы лаборатории могут выбрать проведение анализа RdRp со специфичным для SARS-CoV-2 зондом. В данной работе выбрана последовательность праймеров для определения гена E, которая почти полностью комплементарна последовательности SARS-CoV-1 за исключением первого нуклеотида в прямом праймере, который слабо влияет на эффективность амплификации. Таким образом, диагностическая стратегия в этом тесте основана на том, что атипичная пневмония была ликвидирована у людей (последний зарегистрированный человек с ОРВИ был выявлен в 2004 году) и результаты положительные по гену E могут считаться положительными на наличие SARS-CoV-2.

К настоящему времени доступно большое количество ПЦР-тестов как для использования внутри организаций, так и в коммерческой продаже. Оптимальным считается использование системы, определяющей не менее двух независимых мишеней в геноме вируса. Такой подход снижает вероятность получения ложноотрицательных результатов вследствии появления мутаций, которые могут затрагивать места гибридизации праймеров. Не все мутации в областях связывания праймера/зонда приводят к существенному изменению эффективности теста. Для подтверждения чувствительности используемой тест-системы необходима не только теоретическая, но и экспериментальная оценка эффективности гибридизаци. При использовании коммерческих тестов крайне важно принимать во внимание возможность получения неудовлетворительных результатов.

Тереоретическая оценка специфичности гибридизации праймеров является важным этапом в разработке тест-систем. В работе изложен комплексный подход к биоинформатической оценке ПЦР-диагностических анализов на SARS-CoV-2. Применение этой стратегии к 27 ранее разработанных тест-систем с использованием 17 027 вирусных последовательностей показали мутации/несоответствия в областях связывания праймера/зонда в семи наборах праймеров и зондах. Независимо от этой работы, T. Pillonel также обнаружил в тест-системе на ген RdRp, разработанной Corman et al., несоответствие которое затрагивает 1 623 последовательности, опубликованных в NCBI. Замена S(G/C) на R (A/G) в обратном праймере CARATGTTAAA(S→R)ACACTATTAGCATA позводяет добиться 100% чувствительности. Эти работы и примеры показывают важность постоянного мониторинга мутаций в местах связывания праймеров.