Вирус SARS-CoV-2 является седьмым из числа известных коронавирусов, которые способны заражать человека (коронавирусы человека). Четыре из этих вирусов - 229E, NL63, HKU1 и OC43 - являются эндемичными сезонными вирусами, которые, как правило, вызывают респираторные заболевания легкого течения. В 2002 г. и 2012 г. появились вирусы SARS-CoV и MERS-CoV, которые способны вызывать тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС) и отнесены ко II группе патогенности. С декабря 2019 г. распространение получил новый короновирус SARS-CoV-2, а 11 марта 2020 г. ВОЗ объявила о начале пандемии COVID-19. SARS-CoV-2 включен в перечень заболеваний, представляющих опасность для окружающих (постановление Правительства Российской Федерации от 31 января 2020 г. № 66). В настоящее время диагностика острой инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, основана на методе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. В качестве мишеней обычно используются области генов вируса N, E, S и RdRP.

Геном SARS-CoV-2
Рисунок 1. Геном SARS-CoV-1.

SARS-CoV-2 имеет одноцепочечную положительную нить РНК длиной примерно 30 000 п.о. Геном вируса кодирует 27 белков, включая РНК-зависимую РНК полимеразу (RdRP) и 4 структурных белка: S - белок шипа, E - белок оболочки, M - белок мембраны и N - нуклеокапсидный белок (Рис. 1). В начале января 2020 г была получена первая последовательность генома SARS-CoV2 (MN908947). По мере распространения вируса, начинают создаваться и пополняться базы данных генетических последовательностей новых штаммов (NCBI, GISAID). Эти базы данных рекомендуется использовать для мониторинга мутаций, потенциально влияющих на эффективность теста.

ПЦР-системы

Первая тест-системой для определения вируса была разработана в Институте Вирусологии в Берлине еще до получения образцов вируса [1]. Corman et al. смоделировал геном SARS-CoV-2 на основе генома SARS-CoV-1 и экспериментально подтвердили работоспособность системы. Для рутинного процесса был рекомендован анализ гена E в качестве инструмента скрининга первой линии с последующим подтверждающим тестированием с помощью анализа гена RdRp. Использование двухканальной системы детектирования при определении гена RdRp позволяет отличить SARS-Cov-2 (оба канала дают положительный результат) от SARS-CoV-1. В качестве альтернативы лаборатории могут выбрать проведение анализа RdRp со специфичным для SARS-CoV-2 зондом. В данной работе выбрана последовательность праймеров для определения гена E, которая почти полностью комплементарна последовательности SARS-CoV-1 за исключением первого нуклеотида в прямом праймере, который слабо влияет на эффективность амплификации. Таким образом, диагностическая стратегия в этом тесте основана на том, что атипичная пневмония была ликвидирована у людей (последний зарегистрированный человек с ОРВИ был выявлен в 2004 году) и результаты положительные по гену E могут считаться положительными на наличие SARS-CoV-2.

К настоящему времени доступно большое количество ПЦР-тестов как для использования внутри организаций, так и в коммерческой продаже. Перечень зарегистрированных в РФ диагностических наборов реагентов для выявления РНК SARS-CoV-2 представлен в Государственном реестре медицинских изделий. С Оптимальным считается использование системы, определяющей не менее двух независимых мишеней в геноме вируса [2]. Такой подход снижает вероятность получения ложноотрицательных результатов вследствии появления мутаций, которые могут затрагивать места гибридизации праймеров. Не все мутации в областях связывания праймера/зонда приводят к существенному изменению эффективности теста. Для подтверждения чувствительности используемой тест-системы необходима не только теоретическая, но и экспериментальная оценка эффективности гибридизаци. При использовании коммерческих тестов крайне важно принимать во внимание возможность получения неудовлетворительных результатов.

Тереоретическая оценка специфичности гибридизации праймеров является важным этапом в разработке тест-систем. В работе [3] изложен комплексный подход к биоинформатической оценке ПЦР-диагностических анализов на SARS-CoV-2. Применение этой стратегии к 27 ранее разработанных тест-систем с использованием 17 027 вирусных последовательностей показали мутации/несоответствия в областях связывания праймера/зонда в семи наборах праймеров и зондах. Независимо от этой работы, T. Pillonel также обнаружил в тест-системе на ген RdRp, разработанной Corman et al., несоответствие которое затрагивает 1 623 последовательности, опубликованных в NCBI [4]. Замена S(G/C) на R (A/G) в обратном праймере CARATGTTAAA(S→R)ACACTATTAGCATA позводяет добиться 100% чувствительности. Эти работы и примеры показывают важность постоянного мониторинга мутаций в местах связывания праймеров.

SARS CoV 2 flow of primer design
Рисунок 2. Схема разработки SARS-CoV-2 тест-систем [5].

В рабое Li at al. [5] проведен обзор основных этапов в разработке SARS-CoV-2 тест-систем: определение целевой последовательности, принципов подбора последовательности праймеров и зондов, подбор вырожденных последовательностей для учета вариаций в геноме вируса. Предполагается, что более консервативный ген Е является мишенью для пан-коронавирусного анализа, в то время как гены N и RdRp используются в качестве мишеней для подтверждающих анализов. В работе показана схема разработки тест-систем (Рис. 2), включающая как теоретические, так и практические этапы оценки диагностических характеристик систем.

Литература

  1. V. Corman, O. Landt, M. Kaiser, R. Molenkamp, A. Meijer, D. Chu, T. Bleicker, S. Brünink, J. Schneider, M. Schmidt, D. Mulders, B. Haagmans, B. van der Veer, S. van den Brink, L. Wijsman, G. Goderski, J. Romette, J. Ellis, M. Zambon, M. Peiris, H. Goossens, C. Reusken, M. Koopmans, C. Drosten / Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR // Euro Surveillance, 2020, 25(3)
  2. Диагностическое тестирование для определения вируса SARS-CoV-2: Временные рекомендации, 11 сентября 2020 г.
  3. K. Khan, P. Cheung / Presence of mismatches between diagnostic PCR assays and coronavirus SARS-CoV-2 genome // Royal society open science, 2020, 7(6)
  4. P. Trestan, S. Valentin, J. Katia, G. Gilbert, B. Claire / Letter to the editor: SARS-CoV-2 detection by real-time RT-PCR // Euro Surveillance, 2020, 25(21)
  5. D. Li, J. Zhang, J. Li / Primer design for quantitative real-time PCR for the emerging Coronavirus SARS-CoV-2 // Theranostics, 2020, 10(16), 7150-7162

Добавить комментарий


Защитный код
Обновить