Каждый цикл полимеразной цепной реакция представляет собой ряд последовательных событий: диссоциация двухцепочечных молекул ДНК, гибридизация праймеров, присоединение ДНК-полимеразы и элонгация комплементарной цепи. Эффективность всего цикла является результатом эффективности каждого этапа, но наибольший эффект вносит эффективность гибридизации праймеров. Под эффективностью гибридизации праймеров понимается доля одноцепочечных молекул ДНК, к определенному участку которых присоединен праймер. Существует два типа подходов, которые связывают последовательность праймеров и температуру гибридизации: эмпирические и термодинамические. Эмпирические подходы основаны на экспериментальных значениях температуры гибридизации и валового состава праймеров (длина, %GC). Термодинамические подходы описывают равновесное состояние реакции гибридизации при помощи термодинамических параметров (свободная энергия Гиббса, энтропия, энтальпия), которые определяются нуклеотидной последовательностью праймеров. Но важно помнить, что оба этих подхода описывают равновесные процессы, в то время как механизм цепной реакции подразумевает и влияние кинетических факторов.

Эмпирические подходы

Самой простой формулой, связывающей температуру денатурации олигонуклеотидов (Td) с их валовым составом, является формула Уоллеса-Икатура:

Td(°C) = 2(A+T) + 4(C+G)

Wu немного модифицировал эту формулу для определения температуры гибридизации (Tp):

Tp(°C) = 22 + 1.46((A+T) + 2(C+G))

Одним из следствий этих формул является то, при увеличении длины происходит увеличение температуры гибридизации, и, следовательно, для больших молекул такие подходы дают большую погрешность и не работают. Для оценки температуры плавления молекул ДНК Мармур и Доти предложили формулу, которая связывает температуру плавления с долей оснований C и G (%GC). В дальнейшем в эту формулу включили зависимость от длины (n) концентрации ионов натрия и ионной силы раствора (b) (формула Мармур-Шилдкраут-Доти):

Tm(°C) = 81.5 + 16.6(log[Na+]) + 0.41(%GC) - b/n

В основе всех этих правил лежат экспериментальные данные, поэтому часто их прямое сравнение невозможно из-за различий в экспериментальных условиях. Особенно это актуально при сравнении температур гибридизации, денатурации и плавления, так как в каждой работе они являются разными физическими характеристиками. Для оценки практического применения необходимо проводить эксперименты, фактически проводя работу по подтверждению или уточнению исходных формулу. Существенным ограничением таких подходов является невозможность оценить гибридизацию неполностью комплементарных последовательностей. В этом отношении термодинамические подходы являются более универсальными.

Термодинамические подходы

Химическое равновесие реакции гибридизации

Процесс взаимодействия двух олигонуклеотидов (A и B) с образованием димера (AB) можно описать уравнением реакции:

A + B ↔ AB

При установлении равновесия скорости процессов образования димера и его диссоциации уравновешиваются и равновесные конценрации описываются уравнением:

,

где К — константа равновесия реакции, которая не зависит от начальных концентраций олигонуклеотидов, но зависит от температуры и состава раствора (концентрация солей, детергентов). Зная начальную концентрацию олигонуклеотидов A ([A0]) и B ([B0]), уравнение можно представить в следующем виде:

.

Решив данное уравнение, можно определить равновесную концентрацию димера или его долю по отношению к свободным олигонуклеотидам.

Зависимость константы равновесия от температуры

Константа химического равновесия является термодинамической характеристикой системы и связана с другими термодинамическими характеристиками через уравнениями:

,

где  и  энтальпия и энтропия реакции при стандартных условиях, - свободная энергия Гиббса при температуре T (К). Таким образом, зная энтальпию и энтропию реакции можно рассчитать свободную энергию Гиббса при заданной температуре, константу равновесия и долю гибридизованных олигонуклеотидов.

Для примера рассчитаем долю свободных ампликонов в пороговой точке. Пороговая точка — цикл, при котором интенсивность флуоресценции раствора начала превышать фоновое значение. Концентрацию флуорофоров в этой точке можно принять равной пределу чувствительности системы, т. е. равной пределу детектирования по флуоресцеину. Для ДТ эта величина равна 10-12M. Поэтому начальная концентрация ампликонов в уравнении может быть принята равной 10-12M. Начальная концентрация праймера обычно равна 10-5M. В случае даже если каждый ампликон будет во взаимодействии с праймером, разница будет определяться начальной концентраций праймеров, так как концентрация ампликонов значительно ниже концентрации праймеров. Уравнение можно представить в виде:

 

 

Уравнение представляет собой формулу, по которой можно рассчитать долю гибридизованных праймеров и ампликонов при различных температурах и при различных начальных концентрациях праймеров.

Полученная зависимость отражает один из принципов разработки тест-систем для ПЦР. В зависимости от свободной энергии Гиббса величина влияния начальной концентрации праймеров будет различна. Так может случиться, что для некоторых тест-систем при заданной температуре стадии гибридизации праймеров, влияние концентрации праймеров на эффективность реакции будет более заметно, а для другой системе - нет.

Кинетические факторы цепной реакции

Важным связующим элементом цикла амплификации является процесс диссоциации ампликонов и последующий процесс гибридизации праймеров. После процесса диссоциации ампликонов при понижении температуры энергетически более выгодным является процесс гибридизации ампликонов друг с другом. При дальнейшем понижении температуры становится возможным гибридизация праймеров на ампликон. Исходя из этих предпосылок для обеспечения высокой эффективности амплификации ключевым техническим элементом является скорость охлаждения ПЦР-смеси.

Добавить комментарий


Защитный код
Обновить