Правильный выбор последовательности праймеров является ключевым моментом в разработке реактивов. Гибкость в выборе праймеров в первую очередь определяется задачей. В случае определения однонуклеотидной мутации положение праймеров, например, 3'-конца строго задано, в то время как задача определения возбудителя инфекции может допускать выбор гена и даже мишени (геномной или плазмидной ДНК, РНК). Однако, в любом случае, нуклеотидная последовательность праймеров будет определять селективность, чувствительность анализа и робастность тест-системы.

Длина, Tm, ΔG, ΔH, ΔS, CG-контент

Эффективность реакции определяется эффективностью гибридизации праймеров. Под эффективностью гибридизации праймеров понимается доля целевых молекул ДНК, на которые гибридизовались праймеры. Для обеспечения максимальной эффективности праймеры должны гибридизоваться на каждую молекулу ДНК, т.е. доля ДНК с гибридизованными на нее праймерам должна стремиться к 100%.

Методики расчета температуры гибридизации можно разделить на две группы: эмпирические зависимости, основанные на длине праймеров или содержания CG, и термодинамические подходы, основанные на расчетах свободной энергии Гиббса, энтальпии и энтропии. Так как эмпирические зависимости основаны на практических знаниях, в определенных границах применимости их результаты всегда соответствуют практике. Существенным их недостатком является то, что они не могут оценить вероятность образования димеров праймеров и гибридизацию на неполностью комплементарную последовательность. Расчет термодинамических параметров процесса гибридизации позволяет количественно оценить селективность реактивов и подобрать оптимальную последовательность праймеров и условия ПЦР.

Выбор последовательности 3'-конца

Последовательность 3'-конца праймера имеет критическое значение для селективности анализа, так как именно с этого конца происходит синтез комплементарной последовательности. С одной стороны неполная гибридизация 3'-конца приводит к значительному снижению эффективности элонгации. С другой стороны, чрезмерная стабильность 3'-конца приводит к снижению роли 5'-конца на селективность гибридизации, снижая при этом общую селективность амплификации и увеличивая вероятность образования неспецифических продуктов.

На основе анализа базы данных по праймерам, авторами предложена последовательность шагов для выбора оптимального 3'-концевого триплета:

  1. Отдавать предпочтения триплетам TT(C/G), (C/G)(A/T)(C/G), (A/T)GG, (A/T)CC, (A/T)GC;
  2. Избегать триплеты (A/T)CG, (A/T)(A/T)(A/T), CG(A/T), GGG;
  3. Если шаги 1 и 2 не позволяют сделать однозначный выбор, то следует выбрать триплет с C или G на конце.

 Образование побочных продуктов

Механизм образования побочных продуктов
Рисунок 1. Механизм образования побочных продуктов

В процессе ПЦР, кроме целевого фрагмента ДНК, могут образовываться побочные продукты и их накопление приводит к снижению эффективности амплификации целевого продукта и, следовательно, к снижению чувствительности и селективности анализа. Есть несколько механизмов образования побочных продуктов:

  1. Образование димера между самим праймером (один праймер имеет участок самокомплементарной последовательности) (Рисунок 1. A));
  2. Гибридизация праймеров друг с другом (два праймера имеют комплементарный участок) (Рисунок 1. B));
  3. Неспецифическая гибридизация праймеров на целевой фрагмент ДНК (Рисунок 1. C)).

Полностью исключить процесс образования побочных продуктов невозможно, так как он зависит как от условий реакции (температура и длительность стадий гибридизации и элонгации), так и от самих реактивов (специфичность полимеразы, наличие вспомогательных веществ). При выборе праймеров необходимо иметь возможность ранжировать их по вероятности образования побочных продуктов. Одним из способов ранжирования является расчет свободной энергии Гиббса по методу ближайших соседей. В качестве вариации данного подхода возможно оценивать свободную энергию Гиббса не всей последовательности праймера, а 3'-конца.

Литература

 

Добавить комментарий


Защитный код
Обновить