Выделение ДНК/РНК

Подготовка пробы к анализу заключается в получении раствора нуклеиновых кислот необходимой концентрации. Причем, нуклеиновые кислоты должны быть доступны для амплификации, а раствор должен быть свободен от ингибиторов — веществ, вызывающих снижение эффективности реакции амплификации. Подготовку проб можно условно разделить на два этапа: разрушения образа и этап очистки и концентрирования. Выбранная для каждого отдельного случая и лаборатории методика должна быть максимально простой и обеспечивать при этом необходимую чистоту и концентрацию раствора.

На этапе лизиса образца необходимо обеспечить доступность нуклеиновых кислот для последующей очистки. Лизис образца может быть нескольких типов:

  • Ферментативное (протеиназы)
  • Химическое (хаотропные агенты, детергенты)
  • Механическое (перетирание, измельчение, ультразвук, заморозка/оттаивание, нагрев)

В методике выделения проб стадия гомогенизирования образца может включать комбинацию нескольких типов лизиса, последовательно или одновременно. Например, перетирание, затем обработка протеиназой и потом хаотропными агентами. Отдельная стадия гомогенизации может отсутствовать, а разрушение клеток происходит на стадии нагрева ПЦР-смеси при активации термостабильной полимеразы.

На этапе очистки и концентрирования необходимо получить раствор нуклеиновой кислоты нужного качества, концентрации и чистоты. Этот этап можно систематизировать следующим образом:

  • Удаление нуклеиновых кислот из раствора:
    • осаждение:
      • высаживание из раствора (этанол, изопропанол, высаливание)
      • соосаждение (ПЭГ, CTAB)
    • сорбция:
      • сорбция на кремниевую поверхность
      • аффинная сорбция (гибридизация, олиго-dT)
      • сорбция на ионнообменные смолы (Chelex)
  • Удаление ингибиторов из раствора:
    • фенол/хлороформенная экстракция
    • флоккуляция
    • диализ

Выбор оптимальной методики подготовки проб заключается в поиске баланса между двумя противоречиями:

  • обеспечение максимальной чистоты, концентрации и качества итогового раствора
  • достижение минимальной стоимости и максимальной производительности анализа

Чем больше информации о составе образца, тем легче выбрать оптимальную методику подготовки проб.