Область применения ПЦР можно разделить на две большие части: качественное и количественное определение [1]. К качественному относится скрининг (анализ ряда образцов на один признак), идентификация (анализ одного образца на несколько признаков). К количественному анализу относится изучение экспрессии генов и определение содержания. Данные категории являются условными и на практике границы качественного и количественного анализа размываются. Вне зависимости от конкретного приложения разработка методики анализа включется в себя выбор мишени анализа, выбор типа ПЦР и детекции, ведение контроля.
Выбор мишени анализа
Иногда рамки поставленной задачи допускают выбор мишени анализа. Такая ситуация часто складывается в задачах скрининга и идентификации микроорганизмов. В качестве мишени может служить геномная ДНК, плазмидная ДНК и РНК [2]. Абстрагируясь от методики выделения, выбор мишени определяет чувствительность анализа и интерпритацию результатов. Количество мишений на один микроорганизм (копийность) возрастает от геномной ДНК, плазмидной ДНК и РНК, соответственно, растет и чувствительность анализа. Наличие РНК в пробе предполагает наличие процессов трансляции и транскрипции, т.е. в результате анализа получаются данные о наличие живых и метаболизирующих микроорганизмов. Определение геномной ДНК позволяет выявить наличие микроорганизма вне зависимости от жизнеспособности и стадии жизненного цикла. В этом случае, например, для оценки эффективности лечения необходимо выдержать паузу, чтобы организм вывел следы погибших возбудителей.
Выбор типа ПЦР и детектирования
Методология проведения ПЦР позволяет использовать различные программы термоцилирования и методики детектирования продутов [3]. Температурно-временная программа ПЦР может различаться:
- Количеством стадий. Обычно цикл ПЦР проходит в 3 стадии (денатурация продуктов, гибридизация праймеров и элрнгация праймеров). В двухстадийной ПЦР стадии гибридизации и элонгации объединены и проходят при одной температуре. Это позволяет сэкономить время анализа за счет уменьшения времени, затраченого на переход между температурными стадиями. Так же эти изменения влияют на селективность анализа и на эффективность амплификации.
- Температурой стадии гибридизации праймеров. При "touch-down" и "touch-up" ПЦР происходит изменение температуры стадии гибридизации в зависимости от цикла. При "touch-down" ПЦР происходит постепенное уменьшение температуры, а при "touch-up" - увеличение температуры. Такой подход позволяет повысить специфичность анализа в случае, если положение праймеров четко определено задачей анализа.
Распространены также комбинированные ПЦР:
- В методике вложенной ПЦР на второй проводится амплификация продукта первой ПЦР. Это позволяет увеличить селективность определения с одной стороны, но дополнительные операции с продуктами ПЦР повышают риск контаминации образов.
- При проведении универсальной ПЦР используемые праймеры состоят из двух участков: селективного и универсального. Такие праймеры гибридизуются за счет селективного участка и в результате амплификации накапливается продукт с универсальными концами. После добавления праймеров, комплементарных универсальному концу, проводится дальнейшая амплификация. Такой подход позволяет компенсировать принципиальные различия в эффективности амплификации нескольких участков.
- Для проведения ассиметричной ПЦР при второй амплификации используется только один праймер. Это позволяет накопить определенное количество одиночных нитей ДНК и провести дальнейшее секвенирование.
Контроль
При проведении ПЦР рекомендуется проводить несколько контрольных ПЦР, которые позволяют оценить текущее качество анализа [2]:
- Контроль эффективности выделения НК проводится путем параллельного выделения стандартного или типичного образца. Данный контроль позволяет ответить на вопрос, обусловлен ли отрицательный результат малой эффективности разрушения образца и высвобождения ДНК.
- Для контроля потерь на стадии очистки проводится выделение модельного образца с добавкой, матрица которого близка к матрице анализируемых образцов. Данный контроль позволяет ответить на вопрос, обусловлен ли отрицательный результат потерями на стадии очистки.
- Для контроля ингибирования в полученный после пробоподготовки раствор раствор НК определенной концентрации. По эффективности амплификации можно оценить наличие ингибиторов в полученном растворе НК. Данный контроль позволяет ответить на вопрос, обусловлен ли отрицательный результат наличием ингибиторов в анализируемом растворе.
- Положительный контроль (в качестве образца используется водный раствор НК) позволяет оценить текущее качество реактивов и ответить на вопрос, обусловлен ли отрицательный результат испорценными реактивами.
- Отрицательный контроль позволяет ответить на вопрос, обусловлен ли положительный результат наличием в образце искомой последовальности или обусловлен внешним загрязнением. Если в качестве образца используется раствор, который прошел процесс пробоподготовки, то загрязнение контролируется в процессе всех работ с пробами. Если в качестве образца используется вода - контролируется только исходное качество реактивов и процесс приготовления ПЦР-смеси.
Литература
- RT-PCR Protocols, edited by J. O'Connell // Humana Press, 2002
- E. van Pelt-Verkuil, A. van Belkum, J. Hays / Principles and Technical Aspects of PCR Amplification // Springer, 2008
- G. Viljoen, L. Nel, J. Crowther / Molecular diagnostics PCR handbook // Springer, 2005