Интеркалирующие красители используются для неспецифического детектирования продуктов ПЦР. При взаимодействии с двухцепочеными ДНК их флуоресценция значительно возрастает. Наиболее распространенными интеркалирующими красителями являются этидиум бромид и SYBR Green I. Несмотря на то, что они являются рабочими лошадками молекулярной диагностики, они имеют ряд недостатков: высокая фоновая флуоресценция, низкая температурная стабильность и ингибирование ПЦР. К принципиальным недостаткам можно отнести влияние концентрации красителя на оптимальную температуру гибридизации праймеров и температуру плавления ампликонов. Красители следующих поколений (YO-PRO-1, SYBR® Gold, SYTO, BEBO, BOXTO и EvaGreen) разрабатывались для нивилирования этих недостатков.
Этидиум бромид - это интеркалирующий краситель, который широко используется в лаборатории молекулярной биологии для визуализации ДНК в методе агарозного гель-электрофореза. Спектр поглощения имеет максимум на 210 нм и 285 нм, максимум флуоресценции приходится на 605 нм. Такие спектральные характеристики оказались очень удобны для визуальной оценки результатов агарозного гель-электрофореза. Ультрафиолетовый спектр невидим для глаз наблюдателя, а флуоресценция приходится на видимую область. Однако при работе необходимо помнить о защите глаз и кожи от ультрафиолетового излучения. Этидиум бромид, как и любое соединение, взаимодействующее с ДНК, является мутагеном.
Хотя этидиум бромид использовался в первых опытах по ПЦР в режиме реального времени, он не совсем подходит для этой роли. Ультрафиолетовое излучение, необходимое для возбуждения флуоресценции, может повреждать ДНК и фермент и не может использоваться для постоянного мониторинга концентрации ампликонов. В качестве интеркалирущего красителя для ПЦР широко используется SYBR Green I. Его спектр поглощения имеет максимум на 497 нм, а максимум флуоресцении приходится на 520 нм. Оптическая схема для регистрации флуоресценции требует лучшего спектрального разрешения и сложнее, чем в случае этидиум бромида, но легко реализуема и широко используется в ПЦР-анализаторах. Кроме того, по сравнению с этидиум бромидом, SYBR Green I имеет лучшую температурную стабильность, меньше ингибирует ПЦР, меньше фоновая флуоресценция и выше выход флуоресценции при взаимодействии с ДНК.
Основным недостатком интеркалирующих красителей является их неспецифичность к нуклеотидной последовательности амплифицируемого участка. Поэтому в процессе ПЦР происходит детектирование и неспецифичных продуктов, например, димеров праймеров. Для подтверждения специфичности анализа, особенно при поздних пороговых циклах, проводят плавление продуктов. Получение зависимости интенсивности флуоресценции раствора от температуры позволяет определить температуру, при которой происходит диссоциация ампликонов. Эта точка (температура плавления) зависит от длины ампликона и от его нуклеотидного состава (процент CG). Такой подход позволяет подтвердить специфичность амплификации и выявить наличие димеров праймеров (ложно-положительный результат)
Интеркалирующие красители стабилизируют двухцепочечную молекулу ДНК, поэтому они всегда оказывают влияние на температуру плавления ампликонов. Однако, этим фактом можно пренебречь, если отсутствует зависимость температуры плавления от концентрации красителя, которая ярко выражена у SYBR Green I. SYBR Green I преимущественно взаимодействует с CG-богатыми участками, и это может затруднить интерпретацию кривых плавления. Интерекалирующие красители нового поколения имеют ряд преимуществ, по сравнению с этидием бромидом и SYBR Green I:
- Не ингибируют ПЦР
- Температура плавления ампликонов не зависит от концентрации красителя
- Не наблюдается преимущественного взаимодействия с участками с определенными нуклеотидными последовательностями
- Высокая температурная стабильность
SYTO
Красители SYTO представляют собой большую группу коммерчески доступных цианиновых красителей. Взаимодействие с ДНК обусловлено в основном электростатическим взаимодействием и проходит в малой ложбине. Внутри группы наблюдается большой разброс по увеличению флуоресценции при взаимодействии с ДНК, спектру возбуждения и эмиссии, ДНК/РНК селективности и силе взаимодействия с ДНК. Основываясь на экспериментальных данных по ингибированию ПЦР, эффективности флуоресценции и влиянию на температуру плавления амликонов для ПЦР оптимальными являются красители SYTO 13, 16, 80 и 82. SYTO 16 при проведении плавления ампликонов дает такие же узкие пики, как EvaGreen, которая позиционируется как специальный краситель для получения кривых плавления высокого разрешения.
EvaGreen
Evagreen относится к третьему поколению интеркалирующих флуоресцентных красителей и оптимально подходит для мультиплексной ПЦР с последующим анализом продуктов по кривым плавления высокого разрешения. EvaGreen успешно применяется и для количественной ПЦР, так как обладает высокой температурной стабильностью и не вызывает ингибирования ПЦР. Сходные спектральные характеристики EvaGreen и SYBR Green I (λabs/λem = 500/530 нм) позволяют провести легкую замену этих красителей.