Развитие полимеразной цепной реакции очень похоже на развитие интернета. Эти два открытия произошли примерно в одно время и уже успели несколько раз выйти за границы текущих представлений и возможностей. Их роднит и то, что те задачи, которые они решили в момент открытия, пренебрежимо малы по сравнению с теми возможностями, которые они дали для развития технологии, науки и общества.

 Предпосылки открытия

Первоначальная концепция ПЦР, как и многих других открытий, была комбинацией нескольких существующих техник и принципов:

  • В 1957г. А.Корнберг описал фермент, выделенный из кишечной палочки, который синтезирует нить ДНК из отдельных дезоксирибонуклеотидтрифосфатов [1];
  • В 1970г. К.Клеппе применил синтетические олигонуклеотиды в качестве затравки для синтеза комплементарной последовательности ДНК [2];
  • В 1976г. Дж.Трела выделил термостабильную ДНК-полимеразу из термофильных бактерий Thermus Fquaticus, для которой оптимальной температурой синтеза является 80°С [3].

Эти работы позже стали основанием для патентных споров.

Открытие принципов полимеразной цепной реакции

Кэрри Муллис
Кэрри Муллис

В начале 80-х в компании Cetus в Калифорнии проводились эксперименты, кульминацией которых весной 1983 явились сформулированные Кэрри Муллисом основные принципы полимеразной цепной реакции [4]. За это открытие в 1993г. Муллис получил нобелевскую премию по химии.

Изобретением Мюллиса было использование сразу двух праймеров для того, чтобы специфично амплифицировать определенный участок ДНК. В этом случае праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК и ограничивают амплифицируемый участок. Один из праймеров является затравкой для синтеза комплементарной нити ДНК, которая на следующем этапе будет субстратом для синтеза комплементарной нити ДНК с участием другого праймера [5]. Предложенная система подразумевает использование продуктов одного этапа синтеза комплементарной последовательности как субстрат на следующих этапах, формируя цепную реакцию.

В 1989 г. компания DuPont подала иск к компании Cetus о неправомерном получении патента, в котором утверждала, что ПЦР была уже была описана в работах Клеппе [3],Олсон [6] и Хорана [7]. Спустя 2 года суд подтвердил патент Cetus, который в этом же году был продан Hoffman-La Roche за $300 млн [8].

Термостабильная ДНК-полимераза

Основным недостатком фрагмента Кленова, который использовался Муллисом в первых экспериментах по ПЦР, является его термолабильность [9]. Это приводило к необходимости добавлять свежую партию фермента после каждого цикла денатурации. Кроме явного недостатка - высокой трудоемкости анализа, необходимость регулярного открытия пробирки приводит к риску контаминации реактивов и лаборатории. Использование термостабильной ДНК-полимеразы позволило решить сразу две проблемы [10]. Температурная стабильность этого фермента позволила проводить ПЦР в закрытой пробирке, а высокая оптимальная температура синтеза позволила значительно увеличить селективность анализа.

Сравнение селективности амплификации участка гена β-глобина длиной 167 п.о. с фрагментом Кленова и Taq-полимеразой

Специфичность амплификации определенного участка ДНК, задается нуклеотидной последовательностью праймеров. Чем длинее праймеры, тем они более специфичны к ДНК. Но при увеличении длины уменьшается значимость небольших несоответствий в последовательности праймера и комплементарного участка ДНК. Соответственно, на практике при использовании фрагмента Кленова и низких температур на стадии гибридизации праймеров и элонгации, увеличивается доля неспецифичесных продуктов, которые являются результатом гибридизации праймеров на не полностью соответствующий участок ДНК. Специфичность гибридизации можно повысить путем повышения температуры раствора. Замена фрагмента Кленова на Taq-полимеразу позволило реализовать эту идею и значительно увеличить специфичность амплификации.

Снижение трудоемкости и увеличение селективности анализа значительно подогрело интерес к ПЦР, но для широкого распространения ПЦР в практические сферы деятельности недоставало еще одного фактора - удобного метода детектирования продуктов реакции.

ПЦР в режиме реального времени

Изображение с ПЗС-камеры и кинетические кривые флуоресценции растворов.

Открытие термостабильной ДНК-полимеразы позволило провести ПЦР в закрытой пробирки, но для детектирования продуктов ПЦР пробирку все-таки приходилось открывать. Это значительно ограничивало практические диагностические возможности метода, так как значительно повышало риск контаминации лаборатории. Поэтому Том Вайт, вице-президент исследовательского отдела Cetus, озвучил цель детектирования ампликонов в закрытой пробике [11].

Рус Хигучи, за которым признано открытие "кинетической" ПЦР, в это время работал в исследовательской группе над идеей ДНК-меток для прослеживания ценных или важных предметов, например, денег, взрывчатых или лекарственных веществ. Одним из побочных продуктов их экспериментов было наблюдение, что этидиум бромид, добавленный в пробирку перед проведением ПЦР, не вызывает ингибирования реакции, а количество ампликонов достаточно для детектирования их флуореценции в закрытой пробирке. Для дальнейших экспериментов была собрана экспериментальная установка, которая позволила проводить измерение флуресцении в течении каждого термического цикла и получать кинетические кривые флуоресцении [12]. Такие данные позволяют не только подтвердить наличие интересующей ДНК в образце, но и оценить начальное количество ДНК.

"Кинетическая" ПЦР стала последним недостающим ключом для входа ПЦР в диагностическую область. Возможность проведения ПЦР и детектирования продуктов в закрытой пробирке значительно упростило анализ и увеличило надежность получаемых результатов. Теперь можно проводить масштабные и потоковые исследования не боясь контаминации лаборатории и реактивов и не беспокоясь за правильность получаемых результатов.

Мультиплексная ПЦР

Электрофоретическое детектирование при мультиплексной ПЦР.

Паралельно с развитием кинетической пцр шло развитие мультиплексной ПЦР - варианта ПЦР, при котором проводилась амплификация нескольких участков ДНК в одном растворе. В 1988 г. Томас Кески опубликовал работу, в которой проводился скрининг геномной ДНК на наличие делеций [13]. Идентификация ампликонов проводилось электрофоретически, поэтому длины амплифицируемых участков выбирались так, чтобы быть различимы в геле.

Практическая значимость мультиплексной ПЦР сразу была оценена исследователями и разработчиками:

  • возможность проводить скрининг образоцов, количество которых ограничено;
  • возможность выявить ложноотрицательные результаты за счет амплификации контрольного участка ДНК.

В результате работ по совершенствованию мультиплексной ПЦР появились флуоресцентные зонды, которые позволили детектировать амплификацию определенного участка ДНК. Использование нескольких флуоресцентных зондов с разными спектральными характристиками и разными нуклеотидными последовательностями позволяют раздельно детектировать несколько ампликонов в одном растворе в режиме реального времени.

Хотя Муллис и признается автором ПЦР, над созданием той ПЦР, которую мы сейчас знаем, работало много людей, которые решили целый ряд принципиальных практических ограничений. Так или иначе, с момента открытия ПЦР прошла долгий путь развития для того чтобы занять текущее место в генетическом анализе.

Литература

  1. R .Lehman, M. Bessman,E. Simms, A. Kornberg / Enzymatic Synthesis of Deoxyribonucleic Acid. I. Preparation of substrates and partial purification of an enzyme from escherichia coli // Published in Harvey lectures, 1957
  2. K. Kleppe, E. Ohtsuka, R. Kleppe, I. Molineux, H. Khorana / Repair replication of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases // J. Molecular biology. Biol., 1971, 56, 341-361
  3. A. Chien, D. Edgar, J Trela / Deoxyribonucleic asid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquatics // J. Bacteriology, 1976, 127(3) 1550-1957
  4. J. Bartlett, D. Stirling / PCR Protocols, second edition // Humana Press Inc., 2003
  5. P. Rabinow / Making PCR: A Story of Biotechnology // University of Chicago Press, 1997
  6. K. Olson, T. Gabriel, J. Michalewsky, C. Harvey / Enzymatic multiplication of a chemically synthesized DNA fragment // Nucleic Acids Research, 1975, 2(1), 43-60
  7. A. Panet, H. Khorana / The linkage of deoxyribopolynucleotide templates to cellulose and its use in their replication // The Journal of Biological Chemistry, 1974, 249, 5213-5221
  8. K. Mullis, F. FerréRichard, A. Gibbs / The Polymerase Chain Reaction // Birkhäuser Boston, 1994
  9. K. Mullis, F. Faloona, S. Scharf, R. Saiki, G. Horn, H. Erlich / Specific Enzymatic Amplification of DNA In Vitro: The Polymerase Chain Reaction // Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986
  10. R. Saiki, D. Gelfand, S. Stoffel, S. Scharf, R. Higuchi, G. Horn, K. Mullis, H. Erlich / Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. // Science, 1988, 239, 487-491
  11. T.R. Gingeras, R. Higuchi, L.J. Kricka, Y.M. Lo, C.T. Wittwer / Fifty years of molecular (DNA/RNA) diagnostics // Clinical Chemistry, 2005, 51(3), 661-671
  12. R. Higuchi, C. Fockler, G. Dollinger, R. Watson / Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions // Biotechnology, 1993, 11(9), 1026-30
  13. J. Chamberlain, R. Gibbs, J. Rainer, P. Nga Nguyen, T. Caskey / Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification // Nucleic Acids Research, 1988, 16(23), 1988, 11141–11156

Добавить комментарий


Защитный код
Обновить