Первоначально в полимеразной цепной реакции использовался фрагмент Кленова [1], который является продуктом ферментативного гидролиза ДНК-полимеразы I, выделенной из кишечной палочки. Фрагмент Кленова как и ДНК-полимераза обладает 5’-3’-полимеразной и 3’-5’-эконуклеазной активностью, но не имеет 5’-3’-экзонуклеазной активности. Проведение ПЦР включает в себя обязательную стадию денатурации синтезированных нитей ДНК при температуре 95°C, но при такой температуре происходит деактивация фермента и требуется добавление свежей порции. Проведение 30-40 циклов уже требует значительных затрат времени, фермента и внимания исследователя. К тому же при таком количестве манипуляций возрастает риск контаминации реактивов продуктами реакции. Таким образом, существовала острая практическая необходимость в ДНК-полимеразе, которая сохраняет активность при высокой температуре.

Taq ДНК-полимераза

Сравнение структуры ферментов.

В 1976г. Трела выделил термостабильную ДНК-полимеразу из бактерии Thermophilus aquaticus, живущей в горячих термальных источниках при температуре 70-75°C [2]. ДНК-полимераза (Taq-полимераза), выделенная из этой бактерии, имела схожее строение с ДНК-полимеразой I кишечной палочки, за исключением того, что она не имела фрагмента, отвечающего за 3’-5’-эконуклеазную активность. Taq-полимераза не так быстро инактивировалась при нагреве, как фрагмент Кленова, но потребовалось несколько лет, чтобы реализовать ПЦР с термостабильным ферментом [3]. Использование термостабильной полимеразы позволило провести необходимое количество циклов ПЦР в закрытой пробирке без добавления свежего фермента. Это резко подняло интерес к практическому применению ПЦР.

По сравнению с фрагментом Кленова, Taq-полимераза имеет ряд преимуществ [4]:

  • При температуре 95°C сохраняется 50% активности в течении 40 мин, при температуре 92,5°C — 130 мин, 97,5°C — 5-6 мин. Это значит, что после 50 циклов с денатураций 20 с при температуре 95°C, ещё остаётся 50% активности;
  • Во время проведения ПЦР не требуется добавление свежих порций фермента, что значительно снижает трудоёмкость и вероятность контаминации реактивов и лаборатории;
  • Высокая оптимальная температура синтеза позволяет снизить неспецифическую гибридизацию праймеров и образование вторичной и четвертичной структуры ДНК, которая затрудняет гибридизацию и синтез комплементарной последовательности;
  • Отсутствие фрагмента, отвечающего за 3’-5’-эконуклеазную активность приводит к большей скорости синтеза комплементарной последовательности, по сравнению с фрагментом Кленова;
  • Taq-полимераза способна синтезировать фрагменты ДНК длиной до 4000 п.о., в то время как при использовании фрагмента Кленова длина нуклеотидной последовательности ограничена 400 п.о.
  • Итоговая концентрация ампликонов при использовании Taq-полимеразы примерно в 10 раз выше, чем при использовании фрагмента Кленова;
  • При синтезе Taq-полимераза добавляет аденозин к тупым концам двойной цепочки амплифицируемого участка, что может быть использовано для дальнейшего клонирования.

Модификация Taq ДНК-полимеразы

Повышенный интерес к ПЦР и Taq-полимеразе привел к двум модификациям:

  • Для коммерческих целей Taq-полимеразу выделяли из генетически-модифицированных культур кишечной палочки. Это позволило не только снизить стоимость и увеличить количество получаемого фермента. В выделенном ферменте отсутствовали термостабильные нуклеазы, которые вызывали гидролиз исходной ДНК и синтезированных ампликонов;
  • Появились ферменты (ДНК-полимеразы с «горячим стартом»), активность которых появляется только после термературного нагрева, обычно 5-10 мин при 95°С. Такая модификация позволяет предотвратить неспецифическую амплификацию, проходящую в процессе приготовления смеси и при первоначальном нагреве. Модификация фермента может проводиться несколькими способами:
    • генетическая модификация ДНК-полимеразы, в результате которой фермент сворачивается в неактивную форму, а при нагреве трансформируется в активную. Примерами таких ферментов являются Thermo-start [5], Proofstart [6] и FastStart;
    • добавление в смесь ингибитора активности, который связывается с активным сайтом ДНК-полимеразы, но при нагреве диссоциирует. Температура диссоциации должна быть ниже, температуры при которой проводится стадия элонгации. Такой механизм используется в HS TaQuant-OFF [7];
    • добавление в смесь антитела, который связывается с активным сайтом ДНК-полимеразы, а при нагреве происходит денатурация антитела и его диссоциация [8]. Такой механизм наиболее распространён и используется в ферментах Taq Platinum, JumpStart.

Применение Taq-полимеразы, конечно, не решило всех проблем. Исследователями продолжается поиск новых ферментов для снижения количества неспецифических продуктов, увеличения точности синтеза и длины синтезируемого участка. Так же востребованы ферменты, которые позволяют проводить анализ сложных образцов (цельной крови или её фракций, биологических образцов, образцов окружающей среды) без выделения ДНК.

Литература

  1. Mullis K., Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn G., Erlich H. Specific Enzymatic Amplification of DNA In Vitro: The Polymerase Chain Reaction // Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986
  2. Chien A., Edgar D., Trela J. Deoxyribonucleic asid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquatics // Journal of Bacteriology, 1976, 127(3), 1550-1957
  3. Saiki R., Gelfand D., Stoffel S., Scharf S., Higuchi R., Horn G., Mullis K, Erlich H. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science, 1988, 239, 487-491
  4. Pelt-Verkuil E., Belkum A., Hays J., Principles and Technical Aspects of PCR Amplification // Springer, 2008
  5. Thermo Scientific Thermo-Start Taq DNA Polymerase
  6. ProofStart™PCR Handbook
  7. New products for molecular biology // Molecular Biotechnology, 1999, 11(1), 109–111
  8. Kellogg D., Rybalkin I., Chen S., Mukhamedova N., Vlasik T., Siebert P., Chenchik A. TaqStart Antibody: "hot start" PCR facilitated by a neutralizing monoclonal antibody directed against Taq DNA polymerase // BioTechniques, 1994, 16(6), 1134-1137

Добавить комментарий


Защитный код
Обновить