В середине 80-х проведение полимеразной цепной реакции было очень трудоемким процессом. Требовалось регулярно, с секундной точностью проводить перенос пробирок между ваннами с разной температурой (термоцилировать) и добавлять свежую партию фермента после стадии денатурации.

 
Рисунук 1. Pro Pette Sampling System (слева) и "Mr.Cycler" (справа).

Вполне естественно, что первой автоматической версией ПЦР-амплификатора являлся самодельный переделенный автоматический дозатор жидкостей Pro Pette Sampling System ("Perkin Elmer Cetus Instruments"), получивший название “Mr. Cycle” (Рис.1, Рис.2 A). Планшеты для фиксации пробирок были переделаны в термостаты с водяным нагревом, перемещение пробирок между которыми позволило проводить термоциклирование. Дозирующий модуль позволил упростить добавление свежей партии фермента. "Mr. Cycle" до сих пор хранится в Национальном музее американской истории.

Разработку оборудования для ПЦР Cetus проводила совместно с компанием Perkin Elmer в рамках компании "Perkin Elmer Cetus Instruments" (Рис. 2). Открытие термостабильных ДНК-полимераз позволило отказаться от регулярного добавления свежего фермента, значительно упростив требования к оборудованию. В следующем поколении ПЦР-термоциклеров использовался элемент Пельтье, который охлаждал и нагревал блок с пробирками (Рис.2 B, C). Приборы на основе элемента Пельтье оказались недостаточно надежными, поэтому в дальнейшем термоцилирование проводилось за счет резистивного нагревателя и конвекционного охлаждения (Рис.2 D, E).

Рисунок 2. Линейка ПЦР-термоциклеров Perkin Elmer Cetus Instruments, источник Springham D., Moses V., Cape R "Biotechnology - The Science and the Business", CRC Press, 1999.
Рисунок 3. T100 Thermal Cycler, Bio-Rad.
Рисунок 4. MiniOpticon Real-Time PCR System, Bio-Rad.

Реализация ПЦР в режиме реального времени привела к эволюции ПЦР-термоциклеров в ПЦР-анализатор, который содержал не только блок термоцилирования, но и систему флуоресцентного детектирования продуктов реакции. Это развитие легко наблюдать на примере линейки оборудования компании Bio-Rad, в которой блок детектирования является дополнительной "пристройкой" к блоку термоциклирования. Блочное устройство ПЦР-анализаторов приводит к возможности независимого развития систем термоциклирования и детектирования.

Системы термоциклирования

Время ПЦР-анализа определяется в том числе и скоростью термоциклирования, т.е. от временем, которое затрачивается на температурные переходы между стадиями. Реализации циклического изменения температуры может обеспечиваться пассивными или активными системами термоциклирования. Примерами пассивного охлаждения и нагрева являются "Mr.Cycler" и проточные чипы. В них нагрев и охлаждение осуществляются за счет элементов с постоянной заданной температурой. Эффективность нагрева и охлаждения в этих системах обратно пропорциональна разницы температур, т.е. чем ближе температура реактора к заданной (температуре блока нагрева или охлаждения), тем медленне идет теплопередача и тем медленнее скорость изменения температуры. Преимуществом таких систем является точность и равномерность температуры, отсутствие временного перегрева или переохлаждения ПЦР-смеси.

К активным системам относятся системы, нагревательный или охлаждающий элемент которых, в процессе термоциклирования имеет температуру отличную от заданной. К таким системам относится большинство термоциклеров. В качестве элемента нагрева может использоваться резистивный (металлический или керамический) элемент, в качестве охлаждающего элемента может использоваться воздух. Особняком в этом ряду стоит элемент Пельтье, который позволяет путем смены направления тока нагревать или охлаждать реактор. Существенным преимуществом элементом Пельтье является то, что он позволяет более эффективно (по сравнению с воздушным) охлаждать реактор, так как его температура его поверхности может быть ниже нуля.

Ключевыми характеристиками для обеспечения высоких скоростей термоциклирования являются:

  1. низкая теплоемкость блока.
  2. высокая теплопроводность блока.

Системы детектирования

Определение содержания ампликонов в растворе проводится путем измерения флуоресценции раствора. В качестве флуоресцирующих веществ используются интеркалирующие красители или флуоресцентные зонды. В первом случае происходит неспецифическое детектирования содержания двухцепочечных ДНК в растворе. При использовании флуоресцентных зондов с разными спектральными характеристиками возможно провести селективное определение нескольких участков ДНК с заданной нуклеотидной последовательностью (мультиплексная ПЦР). Принципиально, системы флуоресцентного детектирования можно разделить на две группы:

  1. Сканирующие оптические системы, в которых проводится последовательное измерение флуоресценции в пробирках.
  2. Матричные оптические системы, в которых в качестве детектора используется ПЗС-матрица, которая проводит измерение одновременное измерение флуоресценции во всех растворах.

Добавить комментарий


Защитный код
Обновить