Основой ПЦР является повторяющиеся циклы in-vitro синтеза определенного участка ДНК, приводящие к геометрическому росту (амплификации) количества копий этого участка ДНК в растворе. В результате каждого цикла амплификации происходит удвоение количества копий ДНК (ампликонов) в растворе, а повторение цикла амплификации приводит к увеличению количества молекул ДНК в геометрической прогрессии.
Каждый цикл полимеразной цепной реакция представляет собой ряд последовательных событий: диссоциация двухцепочечных молекул ДНК, гибридизация праймеров, присоединение ДНК-полимеразы и элонгация комплементарной цепи. Эффективность всего цикла является результатом эффективности каждого этапа, но наибольший эффект вносит эффективность гибридизации праймеров. Под эффективностью гибридизации праймеров понимается доля одноцепочечных молекул ДНК, к определенному участку которых присоединен праймер. Существует два типа подходов, которые связывают последовательность праймеров и температуру гибридизации: эмпирические и термодинамические. Эмпирические подходы основаны на экспериментальных значениях температуры гибридизации и валового состава праймеров (длина, %GC). Термодинамические подходы описывают равновесное состояние реакции гибридизации при помощи термодинамических параметров (свободная энергия Гиббса, энтропия, энтальпия), которые определяются нуклеотидной последовательностью праймеров. Но важно помнить, что оба этих подхода описывают равновесные процессы, в то время как механизм цепной реакции подразумевает и влияние кинетических факторов.
Интеркалирующие красители используются для неспецифического детектирования продуктов ПЦР. При взаимодействии с двухцепочеными ДНК их флуоресценция значительно возрастает. Наиболее распространенными интеркалирующими красителями являются этидиум бромид и SYBR Green I. Несмотря на то, что они являются рабочими лошадками молекулярной диагностики, они имеют ряд недостатков: высокая фоновая флуоресценция, низкая температурная стабильность и ингибирование ПЦР. К принципиальным недостаткам можно отнести влияние концентрации красителя на оптимальную температуру гибридизации праймеров и температуру плавления ампликонов. Красители следующих поколений (YO-PRO-1, SYBR® Gold, SYTO, BEBO, BOXTO и EvaGreen) разрабатывались для нивилирования этих недостатков.