При разработке реактивов исследователь нужно пройти три этапа: планирование, экспериментальная часть и выводы. На стадии планирования работ необходимо сформулировать цель и критерии ее достижения, составить список задач и оценить материально-техническую базу. На экспериментальном этапе проводится подбор праймеров и зондов, оптимизация условий реакции и валидация итоговой методики. После окончания экспериментальной части проводится оформление результатов и их оценка по критериям достижения поставленной цели. Детальное наполнение этих этапов зависит от специфики решаемых задач и области работы лаборатории, но каждый из этих этапов в том или ином виде содержит ряд обязательных пунктов, которые будут подробнее рассмотрены далее.
Планирование работы:
- постановка цели, формулирование критериев достижения цели и принципов разработки;
- ограничение области применения результатов работы
- сбор информации, обзор литературы
- дизайн анализа, тип ПЦР, контроль
- выбор генетических элементов
- определение необходимой материальной базы
- планирование работы
Экспериментальная часть:
- теоретический подбор праймеров
- проверка и оптимизация реакции
- определение характеристик:
- специфичность
- линейность
- предел обнаружения
- воспроизводимость
- робастность
- диагностические характеристики
Выводы:
- оформление результатов
- подведение итогов: соответствие результатов цели и критериям ее достижения
Планирование
Постановка цели
Разработка реактивов для проведения ПЦР начинается с постановки цели и формирования критериев ее достижения. На этом этапе необходимо четко сформулировать три вещи:
- Цель работы — описание результата работы
- Критерии достижения цели — перечень необходимых характеристик результата
- Принципы работы — то, что побудило начать работы по разработке реактивов
Цель и критерии ее достижения тесно связаны друг с другом и объединяются в некоторых методиках постановки целей, например, SMART (Specific, Measurable, Achievable, Relevant, Time bound). По методике SMART цель должна быть конкретной, измеримой, достижимой, значимой и ограниченной по времени. Такой подход позволяет увеличить вероятность достижения цели, однако, такая сильная конкретизация приводит к избирательности внимания. Одновременная формулирование принципов разработки позволяет сбалансировать формализм в достижению цели и гибкость в выборе направления работы. Например, цель работы может быть сформулирована как "в течении 1 недели подобрать подобрать 2-3 пары праймеров для определения Хламидии Трахоматис в рамках разработки набора реактивов для определения инфекций передающихся половым путем (ИППП)". Такая формулировка цели полностью соответствует подходу SMART. Однако, такая цель может быть достигнута путем простого поиска нескольких научных статей, в которых указываются последовательности праймеров. Такое решение никак не масштабируется. Решение заняться разработкой реактивов было принято в рамках расширение возможностей лаборатории по разработки реактивов специфичных для профиля клиники или института. Такой принцип сразу отметает копирование последовательностей из статей, а ставит необходимость в поиске и оценки алгоритмов подбора праймеров. Такое решение приводит к увеличению знаний лаборатории и может масштабироваться не только на реактивы для выявления ИППП, но и на любые другие области.
Ограничение области применения
Понимание ограничений метода в целом и методики в частности является необходимым для получения достоверных результатов. ПЦР дает ответ на вопрос "Есть ли в образце фрагмент нуклеиновой кислоты с определенной последовательностью нуклеотидных оснований?", но не дает ответа на вопрос "Какой микроорганизм содержится в этом объекте?". Например, анализ образца на содержание ГМО с использованием реактивов, специфичных на разрешенные линии ГМО, дает ответ на наличие содержание разрешенных ГМО в образце. При этом подразумевается, что наличие неразрешенных линий ГМО остается неизвестным. Наличие в биологическом образце ДНК определенного инфекционного возбудителя без клинической картины не позволяет говорить о том, развивается ли инфекции или это уже мертвые возбудители.
Сбор информации
Поиск и обзор литературы проводится с целью сужения поставленных задач до уровня планирования экспериментов и оценки объема предстоящей работы. Источниками информации могут служить научная литература (книги и статьи), документы профильных организаций и специализированные форумы и конференции. В подавляющем числе задач достаточно информации, которая находится в открытом доступе и доступна в интернете.
Дизайн анализа
Разработка дизайна анализа предполагает ответ на следующие вопросы:
- Каким будет способ и условия отбора пробы?
- Какой будет методика выделения нуклеиновых кислот?
- Будет ли стадия перед проведением ПЦР? Например, обратная транскрипция или вложенная ПЦР.
- Какой будет метод детектирования? Например, ПЦР в режиме реального времени или детектирование по конечной точки.
- Как будет организован анализ результатов? Например, расчет порогового цикла, электрофорез ампликонов или рестрикция продуктов и последующий электрофорез.
- Как будут интерпретироваться результаты?
Для обеспечения правильной интерпретации результатов в эксперименте необходимо наличие следующих контролей:
- Контроль полноты выделения нуклеиновых кислот из пробы
- Контроль чистоты пробы после выделения
- Положительный контроль реактивов, в том числе, стадии обратной транскрипции и рестрикции.
- Отрицательный контроль реактивов и среды
Определение необходимой материальной базы
Материально техническая база должна обеспечить работу по разработке реактивов так, чтобы не затрагивать и не мешать текущим работам лаборатории. Материальное обеспечение разработки можно разделить на две группы: оборудование и контрольные образцы. В зависимости от необходимых работ, кроме амплификатора, могут потребоваться термостат и насос для проведения пробоподготовки, установка для проведения электрофореза и детекции продуктов в геле и т.д. При работах необходимо определиться и запастись положительными и отрицательными контрольными образцами, реактивами для приготовления модельных растворов.
Планирование работы
В планировании есть два принципиальных подхода: каскадная модель и гибкое проектирование. Обе модели представляют собой две крайности. Каскадная модель представляет собой большой пакет согласованной документации, которая подробно описывает весь процесс работы над проектом. Гибкая модель представляет процесс разработки как последовательность итераций, при этом по результатам текущей итерации планируется следующая. В реальности оптимальным является промежуточная модель, которая сочетает с собой планирование этапов и описание продукта и итерационный подход к текущей работе.